La campaña de Gotham Knights se pone en marcha en la Universidad de Gotham, donde los Caballeros llegan siguiendo la última pista de Batman mientras intentan dar con el Dr. Kirk Langstrom, también conocido por Man-Bat. Los primeros minutos de juego sirven para hacerse con el gancho, los controles de movimiento y poner en práctica las mecánicas de investigación. Cuando se terminan las pesquisas en el campus, Batgirl se dispone a abandonar las instalaciones, pero a su salida se encuentra a varios miembros de la banda Freaks.
Batgirl domina diferentes estilos de lucha, como kickboxing, capoeira o jiu-jitsu, y su arma favorita es la tonfa.
Gotham Knights se desarrolla en un universo en el que Batman ha muerto, así que los diferentes grupos de maleantes y los supervillanos de Gotham se han envalentonado. Como protectora de la ciudad, Batgirl no tiene más remedio que repartir estopa. Esta situación sirve para activar una serie de tutoriales que valen para poner en práctica diferentes formas de deshacerse de los enemigos, incluyendo los ataques directos para los combates cuerpo a cuerpo y las acciones más sigilosas como las emboscadas (terrestres y aéreas).
El metraje termina con Batgirl en la biblioteca del campus, lugar donde muestra su gameplay despachando a unos cuantos Freaks, rescata a estudiantes y se enfrenta a un mini jefe cuyo repertorio de movimientos parece bastante limitado.
Los jugadores de Gotham Knights podrán elegir si completar la campaña solos o en modo cooperativo para hacerlo junto a un compañero. El contenido será el mismo para los cuatro Caballeros, pero cada uno de ellos ofrecerá un estilo de juego diferente y sus diálogos así como las animaciones cambiarán. A nivel de historia, Gotham Knights aún tiene que explicar muchas cosas, incluyendo cómo y dónde muere Batman y quién es el responsable.
